PCR實(shí)驗(yàn)操作

 

    PCR是極為重要的DNA增殖技術(shù)，應(yīng)用層面非常廣，其中包括了核酸探針的制備。如果一段DNA已經(jīng)被次選殖至載體上，要以PCR擴(kuò)增這段DNA時(shí)，可根據(jù)質(zhì)體multiple cloning sites兩邊的序列，選用適當(dāng)?shù)暮怂嵋?（universal primers） 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；比較常用的引子包括SP6, T3 與T7 promoter primer, M13/pUCforward與reverse primers等；若有特殊考量，也可以使用序列專一性核酸引子對(duì)。進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)若同時(shí)添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP，所增殖的DNA即被32P或DIG所標(biāo)定，所以PCR是制備核酸探針非常便捷好用的方法。

 

    儀器用具：微量離心機(jī)；PCR 反應(yīng)器

 

    藥品試劑：

    模版DNA： pBlueGus 質(zhì)體DNA （~50 pg）

    核酸引子對(duì)： T3 promoter primer 與T7 promoter primer （各2 μM）

    礦物油 （是否需要視PCR反應(yīng)器機(jī)型而定）

    PCR DIG probe synthesis kit （Roche）, 內(nèi)含：

    Taq DNA polymerase （Expand High Fidelity, 3.5 U/μL）

    10×PCR DIG probe synthesis mix （2 mM dATP, dCTP, dGTP, 1.9 mM dTTP,及0.1 mM DIG-11-dUTP, pH 7.0）

    Expand high fidelity buffer with MgCl2 （10×）

 

    方法步驟：

    以下反應(yīng)條件主要參照PCR DIG probe synthesis kit 制造廠商所提供的產(chǎn)品說明。

    1）  取一支0.5 mL微量離心管，依下表逐一加入各項(xiàng)試劑 （單位 μL）：

  

    2） 以手指頭輕彈管壁使各項(xiàng)試劑混合均勻。

    3） 短暫離心后，徐徐加入100 μL 礦物油。

    ◆ 有些PCR 反應(yīng)器不需使用礦物油。

    4） 在PCR 反應(yīng)器上設(shè)定PCR 反應(yīng)條件：Denaturation： 94℃/10 min

    擴(kuò)增反應(yīng)：

     30 循環(huán)的 [94℃/45 s → 55℃/1 min → 72℃/2 min]

    zui后的elongation step：72℃/10 min

    5） 將微量離心管移至反應(yīng)器上，并開始進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

    6） 反應(yīng)完成后，以微量移液器吸出礦物油，并取出5 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行洋菜膠體電泳分析。