TCA沉淀過濾法，斑點法

TCA沉淀——過濾法

1．為了檢測放射性標記物結合蛋白質的摻入量，每個樣本吸取一定量（通常為5／／1）加入盛有100t~lBSA溶液（1mg／m1）的1．5m1錐形管中。
2．每管加入lmll0％冰冷的三氯醋酸，混勻。
3．冰上孵育30min。
4．將玻璃纖維濾紙置于一適當的過濾器上，用少量的10％三氯醋酸真空過濾，預先濕潤濾紙。
5．滴加樣本于濾紙的中央，而末摻入標記物則通過濾紙除去，被TCA沉淀的蛋白質則吸附在濾紙上。
6．再用少量的10％三氯醋酸（數毫升）洗滌2次。
7．用少量的95％乙醇洗滌2次。
8．取下濾紙并讓其干燥。將濾紙放在一張鋁箔上，用紅外線燈照射加速其干燥。將干燥的濾紙放入測量瓶中，加入閃爍液，計數cpm。
注：在三氯醋酸中加入非放射性標記的分子可降低檢測的本底。例如氯醋酸中加入蛋氨酸可降低[35S]蛋氨酸的本底。

TCA沉淀——斑點法

1．為了檢測放射性標記物結合蛋白質的摻入量，每個樣本吸取一定量（通常為5ul）與5ulBSA（10mg／m1）溶液混合。
2．將混合后的樣本滴在干燥的玻璃纖維濾紙中央，將濾紙片放在一淺盤或培養皿中。注意濾紙片在使用前應作好標記。
3．小心地用10％冷三氯醋酸（TCA）淹沒濾紙片
4．在冰上或4℃孵育30min．
5．吸出平皿內的三氯醋酸，再加入新鮮的10％冷三氯醋酸，室溫下孵育5min，期間不斷震蕩。再吸出三氯醋酸并重復2次。
6．吸出平皿內的三氯醋酸，再加入95％乙醇，室溫下孵育5min，期間不斷震蕩。
7．取出濾紙片并讓其干燥。將濾紙片放在一張鋁箔上，用紅外線燈照射加速其干燥。將干燥的濾紙片放入測量瓶中，加入閃爍液，計數cpm。
注：在三氯醋酸中加入非放射性標記的分子可降低檢測的本底。例如，在三氯醋酸中加入蛋氨酸可減低[35S]蛋氨酸的本底。www.5g11b.com