gⅥ-cDNA融合噬菌體親和選擇

 

     1噬菌體文庫(kù)的獲取和純化

    在每輪淘選循環(huán)中的起始部分，（富集的）Topl0F，細(xì)胞經(jīng)輔助噬菌體被雙重感染以便產(chǎn)生和純化gⅥ—cDNAt噬菌粒顆粒，從而進(jìn)行下一輪的淘選。在淘選過(guò)程中，如果沒(méi)有特異的緩沖液且噬菌體對(duì)誘餌的親和力較高（如免疫親和篩選），此時(shí)經(jīng)雙重感染獲得的噬菌體顆粒并不一定要純化。

 

    2生物素化的誘餌的制備

    用不同的配體標(biāo)準(zhǔn)化淘選的一個(gè)方法是用普通的標(biāo)記物（如生物素）來(lái)標(biāo)記誘餌，或使用鏈霉親和素包被的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的平板孔或小珠來(lái)淘選。兩個(gè)有效的（氨基反應(yīng)的）生物素化試劑是二硫化N—羥基丁二酰亞胺生物素酯（biotin disulfide N—hydrox—ysuccinimideester）和生物素化氨基己酸—N—羥基丁二酰亞胺（biotinamidocaproate N—hydroxysuccinimide）（Sigma）。與后者試劑相比，前者在生物素和誘餌之間有一個(gè)可切斷的二硫鍵，它是在生物淘選過(guò)程中特異抽提（用50mmol/L二硫蘇糖醇）噬菌體的試劑，整個(gè)生物素的水平可用HABA方法來(lái)評(píng)估。

 

    3用生物素化的誘餌的淘選過(guò)程

    在用生物素化的誘餌來(lái)親和純化gⅥ—cDNA噬菌體顆粒的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程中，用鏈霉親和素包被的磁珠預(yù)處理噬菌粒文庫(kù)，以便首先除去與鏈霉素非特異結(jié)合的噬菌體顆粒。在第三輪淘選后，個(gè)別克隆可用ELISA來(lái)分析或進(jìn)行額外的淘選過(guò)程。然而，必須注意到成功的展示要求pⅥ融合蛋白定位在外周胞質(zhì)上，正確地折疊并組合成完整的噬菌體顆粒。這樣的話，如果表達(dá)pⅥ融合蛋白的結(jié)合者干擾了選擇過(guò)程，那么將會(huì)稀釋“非干擾”結(jié)合者的濃度。

 

    4免疫親和淘選過(guò)程

    用抗血清來(lái)分離gⅥ—cDNA噬菌體顆粒，而且所需要的抗血清是微量的（微升數(shù)量的）。