借助于噬菌體ELISA的DNA/RNA結(jié)合活性的分析

1，將生物素聯(lián)結(jié)的核酸靶標(biāo)位點(diǎn)（通常是0～5pmol之間，稀釋于50ul PBS緩沖液中）加入鏈親和素包被的微孔板內(nèi)。對于陽性對照，將適量的野生型結(jié)合位點(diǎn)加入一個(gè)微孔內(nèi)。用一個(gè)只含PBS緩沖液的微孔作為陰性對照，以測定ELISA的本底。將微孔板于20℃放置15分鐘。
2．每孔加入150gl含有4％（w/v）脫脂牛奶的PBS緩沖液作為封閉劑。將微孔板于20℃放置1小時(shí)。
3，將噬菌體上清液（得自步驟A2）1；10稀釋于lml含有2％（w/v）脫脂牛奶、1％（體積分?jǐn)?shù)）Tween-20及20ug/ml的超聲破碎的鮭魚精DNA的PBS緩沖液中。
4．將核酸包被的微孔中的封閉液棄去，加入50ul稀釋過的噬茵體上清液。將微孔板于20℃放置l小時(shí)。
5．將結(jié)合液棄去，用200ul含1％（體積分?jǐn)?shù)）Tween—20的PBS緩沖液洗滌7次，再用PBS緩沖液單獨(dú)洗滌3次。
6．將HRP聯(lián)結(jié)的抗M131gG抗體用含有2％（w/v）脫脂牛奶的PBS緩沖液作l：5000稀釋，然后每孔加入50g1。20℃放置l小時(shí)。
7．將抗體結(jié)合液棄去，用200ul含0．05％（體積分?jǐn)?shù)）Tween—20的PBS緩沖液洗滌3次，再用PBS緩沖液單獨(dú)洗滌3次。
8．加入100ul HRP底物液，如上文所述的基于TMB的顯色液，使ELISA顯色。約5分鐘后終止顯色反應(yīng)，如使用TMB，則加入100ul 1 mol/L的硫酸。立即用酶標(biāo)儀測定ELISA數(shù)值。
9．要評估篩選出的結(jié)合區(qū)域的特異性序列的結(jié)合性，將它們的ELISA數(shù)值與陽性對照孔和陰性對照孔的數(shù)值進(jìn)行比較。

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