借助于噬菌體ELISA的DNA/RNA結合活性的分析方法

A.噬菌體的制備
1．挑取含有源自文庫篩選的噬菌體克隆的單菌落。用滅菌牙簽挑取單菌落接種于滅菌圓底培養(yǎng)板的微孔內，其中加有150ul含15ug/ml的四環(huán)素的2×TY培養(yǎng)基。用一個微孔培養(yǎng)展示野生型DNA/RNA結合區(qū)域的噬菌體，作為陽性對照。以250r/min的速度小心振蕩微孔板，30℃培養(yǎng)16小時。
2．在合適的吊斗式離心機中3700g離心96孔培養(yǎng)板15分鐘，以制備噬菌體上清液。將上清液轉移到一個新的微孔板內，4℃保存。

B.噬菌體ELISA
1，將生物素聯(lián)結的核酸靶標位點（通常是0～5pmol之間，稀釋于50ul PBS緩沖液中）加入鏈親和素包被的微孔板內。對于陽性對照，將適量的野生型結合位點加入一個微孔內。用一個只含PBS緩沖液的微孔作為陰性對照，以測定ELISA的本底。將微孔板于20℃放置15分鐘。
2．每孔加入150gl含有4％（w/v）脫脂牛奶的PBS緩沖液作為封閉劑。將微孔板于20℃放置1小時。
3，將噬菌體上清液（得自步驟A2）1；10稀釋于lml含有2％（w/v）脫脂牛奶、1％（體積分數(shù)）Tween-20及20ug/ml的超聲破碎的鮭魚精DNA的PBS緩沖液中。
4．將核酸包被的微孔中的封閉液棄去，加入50ul稀釋過的噬茵體上清液。將微孔板于20℃放置l小時。
5．將結合液棄去，用200ul含1％（體積分數(shù)）Tween—20的PBS緩沖液洗滌7次，再用PBS緩沖液單獨洗滌3次。
6．將HRP聯(lián)結的抗M131gG抗體用含有2％（w/v）脫脂牛奶的PBS緩沖液作l：5000稀釋，然后每孔加入50g1。20℃放置l小時。
7．將抗體結合液棄去，用200ul含0．05％（體積分數(shù)）Tween—20的PBS緩沖液洗滌3次，再用PBS緩沖液單獨洗滌3次。
8．加入100ul HRP底物液，如上文所述的基于TMB的顯色液，使ELISA顯色。約5分鐘后終止顯色反應，如使用TMB，則加入100ul 1 mol/L的硫酸。立即用酶標儀測定ELISA數(shù)值。
9．要評估篩選出的結合區(qū)域的特異性序列的結合性，將它們的ELISA數(shù)值與陽性對照孔和陰性對照孔的數(shù)值進行比較。

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