AP融合蛋白的亞克隆和表達(dá)

1．使用來自篩選出的噬菌粒克隆的模版DNA，以及包含與AP融合表達(dá)載體的克隆位點(diǎn)相對應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)的寡核苷酸引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
2．通過瓊脂糖凝膠電泳檢測正確大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。選擇相應(yīng)方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。
3．用對應(yīng)于克隆位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，使用標(biāo)準(zhǔn)的方法將此產(chǎn)物連接到相同酶切后的AP融合蛋白表達(dá)載體中。
4，通過標(biāo)準(zhǔn)的方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，鋪到含100ug/ml氨芐青霉素的LB平板上。挑取單克隆，利用標(biāo)準(zhǔn)的方法（如限制性酶切或PCR）鑒定是否有插入序列。
5，在LB+100ug/m1氨芐青霉素培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)少量（約5m1）的陽性克隆菌液。以l/100接種于適合所用誘導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)培養(yǎng)基中。
6．用適合所用的誘導(dǎo)系統(tǒng)的方法培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)。7500g離心收集細(xì)胞，并棄去上清液。將細(xì)胞沉淀在一20℃冷凍超過4小時，或在酒精/干冰混合物上冷凍10分鐘。
7．輕輕地將細(xì)胞重懸于TE+PMSF緩沖液中以釋放胞質(zhì)蛋白。 離心（7500g）沉淀細(xì)胞并收集上清液。
8．用一個因所用標(biāo)簽而異的方法進(jìn)一步純化融合蛋白。這將使融合蛋白的定量變得更容 易，并能除去可能影響酶解檢測的雜質(zhì)蛋白。但是，如果AP融合蛋白的表達(dá)水平較 高，也可以直接使用胞質(zhì)裂解原液，因?yàn)闄z測中已含有一個有效的親和性純化步驟。9．用SDS—PAGE分析胞質(zhì)蛋白和一系列濃度的基準(zhǔn)純化AP。用凝膠光密度測量法（gel densitometry）將樣品中的AP融合蛋白水平定量。

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