免疫熒光實(shí)驗(yàn)方案 - 甲醛固定

1. 從 Tcunit 收集細(xì)胞，并使用吸力從培養(yǎng)皿中取出培養(yǎng)基。

2. 用 1x PBS 清洗并去除。

3. 將細(xì)胞在預(yù)溫 (37°C) 多聚甲醛中在定軌搖床上室溫孵育 12 分鐘。

4. 除去PFA并在1x PBS中的0.5% Triton X-100中在室溫下孵育5分鐘。

5. 準(zhǔn)備封閉試劑，這也是抗體稀釋液。

6. 在室溫下用 1x PBS 洗滌細(xì)胞 2x，在軌道搖床上洗滌 4 分鐘/洗滌。

7. 用 1% NCS 和 1x PBS 在室溫下封閉 30 分鐘。

8. 準(zhǔn)備一抗（50μl/蓋玻片）和濕染色室。

9. 在室溫下用 lx PBS 清洗細(xì)胞 2x，并短暫風(fēng)干。

10. 在染色室中、黑暗中、室溫下與一抗一起孵育 1 小時(shí)。在此期間準(zhǔn)備二抗。

11. 用 1x PBS 清洗細(xì)胞 5 次（更換燒杯 5 次/每個(gè)燒杯計(jì)數(shù) 5 次）

12. 在染色室中、黑暗中、室溫下與二抗一起孵育 1 小時(shí)。

13. 用 1x PBS 清洗細(xì)胞 5x。

14. 坐于大皮。

溶液（染色當(dāng)天新鮮配制）。

• * 1x 磷酸鹽緩沖鹽水。

• * 封閉試劑：1% NCS，溶于 1x PBS（使用新鮮的 10x PBS）。

• * 固定液：3.5% 多聚甲醛。

1.75g PFA 溶于 20 ml d.H2O 加 5 滴 1M NaOH 中。在 50-60°C 的熱板上攪拌直至溶解。添加 4 滴 HCl 并檢查 pH 指示條。 PH值應(yīng)為7.4。用 d.H2O 補(bǔ)足體積至 25ml，并添加 25ml 2xPBS。添加到蓋玻片之前檢查 pH 值。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)方案 - 甲醇/丙酮固定

1. 從 TCunit 收集細(xì)胞，并使用吸力從培養(yǎng)皿中取出培養(yǎng)基。

2. 用 1x PBS 清洗并去除。

3. 用冷甲醇:丙酮 1:1 在冰上固定細(xì)胞 10 分鐘。

4. 準(zhǔn)備封閉劑，這也是抗體的稀釋劑。

5. 除去固定劑并在室溫下用1x PBS洗滌細(xì)胞3x，在定軌搖床上洗滌4分鐘/洗滌。

6. 在 RT 下用 1% NCS 和 1x PBS 封閉 30 分鐘。

7. 準(zhǔn)備一抗（50μl/蓋玻片）和濕染色室。

8. 在 RT 下用 1 x PBS 清洗細(xì)胞 2x，并風(fēng)干約 7 分鐘。

9. 在染色室中在黑暗中與一抗一起在室溫下孵育 1 小時(shí)。在此期間準(zhǔn)備二抗。

10. 用 1x PBS 清洗細(xì)胞 5 次（更換燒杯 5 次/每個(gè)燒杯計(jì)數(shù) 5 次）

11. 在染色室中在黑暗中與二抗一起在室溫下孵育 1 小時(shí)。

12. 用 1x PBS 清洗細(xì)胞 5x。

13. 坐于大皮。

溶液（染色當(dāng)天新鮮配制）

• * 1x 磷酸鹽緩沖鹽水。

• * 封閉試劑：1% NCS 溶于 1x PBS（使用新鮮的 10x PBS）。

• * 固定液：甲醇:丙酮 1:1 冰冷。

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方案

1. 將凝膠轉(zhuǎn)移到 PDVF 或硝酸纖維素膜上

2. 將膜放入塑料托盤中，并在封閉緩沖液中攪拌一小時(shí)

3. 在洗滌緩沖液中沖洗

4. 在洗滌緩沖液加一抗中孵育一小時(shí)

5. 用洗滌緩沖液洗滌 6 X 5 分鐘

6. 在加二抗的洗滌緩沖液中孵育一小時(shí)

7. 用洗滌緩沖液洗滌 6X 5 分鐘

8. 檢測(cè)（例如 ECL、Amersham 根據(jù)制造商說(shuō)明）

洗滌緩沖液

PBS + 0.1% 吐溫 20

封閉緩沖液

洗滌緩沖液+5%奶粉

所用抗體的濃度取決于每種抗體、抗原的量和所用的檢測(cè)方法。一般來(lái)說(shuō)，稀釋度在幾百倍到幾千倍稀釋范圍內(nèi)，但通常必須憑經(jīng)驗(yàn)確定。